底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）是指代谢物在氧化分解过程中脱氢氧化时，分子内能量重新分布，集中较高的自由能，形成了某些高能磷酸键，它可转移给ADP形成ATP。这种 底物 分子氧化反应与 磷酸化 反应偶联生成ATP的反应过程称为底物水平磷酸化。人体内通过底物水平磷酸化生成ATP的量只占体内ATP生成总量的5％以下。
底物磷酸化是生物氧化生成ATP的次要方式，但在发酵作用中是进行生物氧化取得能量的唯一方式。底物水平磷酸化不依赖于 氧气 ， 在有氧和无氧条件下都能进行，其意义在于它是无氧条件下兼性生物 细胞 或 厌氧 微生物从 有机化合物 取得生物所需能量的主要来源。
名词解释
底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）：是指物质在 脱氢 或脱水过程中，产生高能代谢物并直接将高能代谢物中能量转移到 ADP (GDP)生成 ATP (GTP)的过程。
指在分解代谢过程中， 底物 因脱氢、脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸 基团 转移到ADP形成 ATP 的过程。例如在糖的分解代谢过程 中，甘油醛-3-磷酸脱氢并 磷酸化 生成 甘油酸 1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的 催化 下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给 ADP ，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。
又如甘油酸-2-磷酸脱水生成 烯醇 丙 酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成 ATP 。
又如在 三羧酸循环 中，琥珀 CoA（ 辅酶A ）生成 琥珀酸 ，同时伴有 GTP 的生成，也是底物水平磷酸化。
特点
底物水平磷酸化指高能化合物的放能 水解 作用或与 基团 转移相偶联的 ATP 合成作用。不包括 光合磷酸化 或呼吸链中 氧化磷酸化 的ATP生成过程。例如：糖酵解途径中产生的高能磷酸化合物 甘油酸 1，3-二磷酸和 烯醇 式 磷酸丙酮酸 在酶的作用下，高能磷酸基团转移到 ADP 分子上生成ATP。又如三羧酸循环中产生的高能硫 化合物 琥珀酰辅酶A 在酶的作用下水解成 琥珀酸 ，同时使GDP磷酸化为 GTP ，GTP再与ADP作用生成 ATP 。这些都是底物水平磷酸化的实例。底物水平磷酸化没有共同的作用机制。
差别
对于
1. 氧化磷酸化 偶联 在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量用于 ADP 磷酸化生成 ATP 。氧化是 放能反应 ，而ADP生成ATP是吸能反应，这两个过程同时进行，即氧化时偶联磷酸化的过程称为 氧化磷酸化 。这种方式生成的ATP约占ATP生成总数的80%，是维持生命活动所需能量的主要来源。
2. 电子传递链中 ATP 形成的部位
3. 影响氧化磷酸化的因素
（1） ATP 与ADP的调节作用： ADP/ATP比值下降，说明 细胞 储备ATP较多，所以 氧化磷酸化 速度缓慢甚至停止。反之这个比值升高说明细胞需要 ATP ，于是氧化磷酸化加速进行。
（2） 甲状腺素 的调节作用：导致氧化磷酸化增强，促进物质氧化分解代谢，结果耗氧量和产热量均增加。故甲状腺机能亢进的病人常出现基础代谢率（BMR）增高、怕热，易出汗等症状。
（3） 氧化磷酸化 的 抑制剂 ：氧化磷酸化的抑制剂主要有两类：一是抑制电子传递的抑制剂（呼吸链抑制剂）；另一类是使氧化磷酸化拆离的 解偶联剂 。呼吸链抑制剂的作用与一定部位的 电子 传递体结合而阻碍其电子传递。
氧化 磷酸化 解 偶联剂 不影响呼吸链的电子传递，但能减弱或停止 ATP 合成的磷酸化反应。最常见的解偶联剂是2， 4- 2-硝基苯酚 （ DNP ）。